北京天融慧通科技有限责任公司,labsmart一支高水平生物技术团队，为您的课题文章保驾护航

细胞凋亡检测Tunel法简介

—

由

martin
于 ,
一百多年前，人们就在细胞中观察到了自然发生的细胞死亡现象，然而长期以来它都被视为是一种细胞被动现象。
随着科学探索的逐渐推进，人们逐渐认识到这一现象并非被动地发生，而是一种主动的细胞行为。
如今，细胞凋亡检测运用十分广泛，它不仅可以用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究，还能应用于临床诊疗、新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及肿瘤的基因治疗等，对于相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价也具有举足轻重的地位。
目前研究组织体内细胞凋亡最广泛的方法是Tunel法，它不仅能检测早期基因组的断裂，还能通过标记的多少，进行半定量研究。
一、细胞凋亡和细胞坏死的区别：
区别点

细胞凋亡

细胞坏死
起因 生理或病理性 病理性变化或剧烈损伤
范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞
细胞膜 保持完整，一直到形成凋亡小体 破损
染色质 凝聚在核膜下呈半月状 呈絮状
细胞器 无明显变化 肿胀、内质网崩解
细胞体积 固缩变小 肿胀变大
凋亡小体 有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬 无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬
基因组DNA 有控降解，电泳图谱呈梯状 随机降解，电泳图谱呈涂抹状
蛋白质合成 有 无
调节过程 受基因调控 被动进行
炎症反应 无，不释放细胞内容物 有，释放内容物。
二、凋亡和坏死-形态学区别：

 

三、Tunel法应用：
Tunel是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
四、Tunel法详细的实验步骤：
1. 常规方法制作石蜡切片，用二甲苯浸洗2次，每次5min；
2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次，每次3min；
3. PBS漂洗2次；用Proteinase K工作液(20ug/ml)处理组织15-30 min 在21–37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min；
4. 加入含2%过氧化氢的PBS，室温反应5min，PBS漂洗2次
5. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。
6. 玻片干后，用滤纸小心吸去切片周围多余液体，加50μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。
7. 加入到已预热37℃的洗涤与终止反应缓冲液，37℃保温30min，PBS漂洗3次；
8. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm)；
9. 玻片干后加50μl DIG-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
10. PBS漂洗3次；在组织处加50~100μlDAB底物，反应15~25℃×10min；
11. PBS漂洗3次；拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
12. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体)。
五、注意事项：
(1)出现非特异性荧光标记：组织或细胞未充分固定；使用了不适当的固定液； TUNEL反应时间过长，或反应液渗漏。
(2)荧光背景高：支原体污染片；细胞核中的DNA断裂；TUNEL反应过强；红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。
(3)标记效率低：使用甲醇或乙醇固定；固定时间过长；未避光操作。
六、原位末端凋亡检测(Tunel)技术服务：
我司提供各类组织样品的组织切片凋亡检测服务，只需要您提供相应的组织样品，我们将为您提供详细的试验流程报告、实验图片、实验数据，并返还相应的实验材料(蜡块、切片等)。

 

评论

发表回复

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用 * 标注