杂交瘤细胞克隆化的常用方法

2025年3月20日 11:13:33行业资料细胞培养服务动物和细胞服务评论22阅读模式

杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过 HAT 筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆,在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的方法很多，有有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。这里介绍最简单也是使用最广泛的前两种方法:

一、有限稀释法：

1.1材料：

96 孔细胞培养板、HT 培养基、活力强的杂交瘤细胞、小鼠腹腔细胞

1.2方法：

1、制备小鼠腹腔巨噬细胞（饲养细胞）；

2、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含 20%血清的 HT 培养基稀释至每毫升含 2.5、15、50 个细胞 3 种不同的稀释度；

3、按照每毫升加入 5×10⁴-1×10⁵ 细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞；

4、进行杂交瘤细胞 96 孔板分装，每个稀释度 32 孔，每孔量为 0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为 0.5、3 和 10；

5、37℃、7.5% CO₂ 湿润培养 7-10 天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的阳性孔，再次进行克隆；

6、重复上述步骤 3~5 次，直至阳性孔率 100%；

7、进行抗体检测、细胞胞扩大培养并冻存。

说明：本法中2~4等步骤也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确的进行系列稀释，直至每毫升含 10个细胞，按每孔接种 0.1ml 细胞悬液，即每孔含 1 个细胞。

二、软琼脂法：

2.1材料：

HT 培养基（双倍浓度）、小鼠腹腔细胞、灭菌平皿、活力很好的杂交瘤细胞、45℃水浴、2%琼脂糖生理盐水（用 0.15mol/L NACl 配置的 2.0%琼脂糖，称取 2.0g 细胞培养用琼脂糖，悬浮于 100ml 0.15mol/L NaCl，121℃高压灭菌 15 分钟，分装 10ml 小瓶，冷却后 4℃保存）

2.2方法：

1、在培养皿中制备单层饲养细胞（小鼠腹腔细胞）；

2、临用前将 2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的 HT 培养液混匀，配成 1%琼脂糖培养液，45%水浴中温育；

3、制备杂交瘤细胞悬液：吸取平皿上层培养液，加入 1%琼脂糖培养液 3ml，室温 10 min；

4、取杂交瘤细胞悬液 1ml，加入 1%琼脂糖培养液 1ml 混匀，铺于培养皿上层；

5、37℃、7.5% CO₂ 湿润培养 7-14 天，克隆生长至 2mm 时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的 24 孔板，扩大培养；

6、吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。

三、注意事项：

1、杂交瘤细胞的克隆化需尽早进行，避免其他细胞影响了抗体分泌细胞的生长。注意无菌操作，一旦发现污染必须及时处理。

2、做克隆化培养的小牛血清必须是优质血清。

3、每次克隆化得到的阳性亚克隆，在继续进行克隆化或扩大培养的同时，应及时冻存几支。

杂交瘤细胞克隆化的常用方法