ATAC实验流程材料方法

采用梯度离心的方式提取细胞核，使用Qiagen PCR（28006）纯化试剂盒纯化DNA。

检测方法：取新的1.5ml离心管，加入10ul台盼蓝和10μl样品，枪头吹吸混匀，吸取10μl于细胞计数板上，置于细胞计数仪上进行计数，记录细胞浓度和细胞活性。

合格指标：细胞数大于50000个。

（1）配制打断MIX（如下表所示）

配制完成后，用200ul枪头吹吸混匀上述MIX。

(2) 37℃、700rpm金属浴30min。

（7）室温13000 rpm离心1 min ，离心管底部溶液即为提取的DNA2。

（1）配制PCR MIX ，所用试剂盒为Vazyme TD202 （-20℃保存）将提取的DNA转移至0.2ml PCR管，根据下表配制PCR MIX，配制完成后，用200μ1枪头吹吸混匀上述MIX。

PCR 程序如下：

注意：PCR产物Qubit定量浓度低于10ng/ul， 需加扩2个cycle，加扩时，去掉上述PCR程序的第一步。

（1）将扩增后的PCR体系转移至新的的1.5ml离心管，加入27.5uXP磁珠，枪头吹吸混匀，室温孵育5min；

（2）将离心管置于磁力架上，静置5min至液体澄清；

（3）小心将上清转移到新的1.5ml离心管中；

（4）向上述离心管中加入50uIXP磁珠，枪头吹吸混匀，室温孵育5min；

（5）将离心管置于磁力架上， 静置5min至液体澄清，弃上清，向离心管中加入200ul80%乙醇，室温孵育15s，弃上清，重复该步骤一次；

（6）取下离心管，瞬时离心3s，再次置于磁力架上，用10ul枪头除尽底部残留乙醇；

（7）打开离心管盖子，晾干磁珠至磁珠表面不反光呈雾面状态即可；

（8）取下离心管，加入2luEB，枪头吹吸混匀，室温孵育5min；

（9）将离心管置于磁力架上，待液体澄清后，取出2ul上清液于新的1.5ml离心管进行2100检测，取出1ul进行Qubit定量；

（10）吸取所有剩余上清液于新的1.5ml离心管中（离心管盖上标明文库名称、出库日期、INDEX）。

文库通过Qsep-400方法进行质检，满足如下指标即可上机检测。

1）库检片段呈Ladder状，第一个主峰在200bp左右；

2）片段无前后拖尾，无接头。

使用TruePrepIndexKitV2forlumina构建的DNA文库结构如下

试剂盒中提供包含8种N5XX以及12种N7XX，可组合成96种不同的双端Index组合，用于高通量测序时区分不同样品。

[ⅠⅠⅠⅠⅠⅠ]表示8bp index序列，测序前根据测序平台在Sample Sheet中输入所使用的Index对应序列。

3)产物纯化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads，货号N411-03。

四维旋转仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

10ul，200ul枪头：Axygen。

对于构建好的文库使用illumina novaseg6000进行上机测序。