DNA甲基化（BSP MSP）技术要点

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。CpG位点在基因组是不常见的，主要密集于接近基因启动子的位置，统称为CpG岛CpG岛大约含有500多个碱基，位于基因的启动子区或第一个外显子区。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。

1、甲基化二代测序寻找甲基化位点

对照组和实验组进行甲基化芯片检测，找到相关的甲基化位点；

一些相关研究显示某些基因存在表达量降低的现象，可预测该基因是否存在CpG岛；

根据文献寻找相关基因的甲基化位点。

2、验证甲基化位点，并进行甲基化程度分析

采用对照组和实验组样本进行甲基化验证；

MSP方法：可进行特定位点甲基化验证，适用于甲基化芯片后的结果，无法进行甲基化程度分析；

BSP克隆测序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并计算出精确的甲基化程度百分比；

HRM法：适用于大批量样本甲基化验证，并能计算出甲基化程度范围；

焦磷酸测序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并计算出精确的甲基化程度百分比。

3、分析甲基化位点与研究的相关性

根据对照组和实验组样本的检测结果，分析与研究的相关性；

比较对照组和实验组相同甲基化位点甲基化是否有差异；

比对对照组和实验组相同基因启动子区甲基化程度是否有差异。

4、验证启动子发生甲基化的基因的表达量变化

采用荧光定量PCR的方法检测相关基因的表达量，如果表达量降低，可能由于启动子区发生甲基化导致的，从而影响该基因所在的某些通路，导致一些疾病，或表型发生变化；如果没有发生变化，可能由于发生甲基化的区域与转录因子之间关联不是很密切，从而不会影响基因的表达。

样本要求：

1、DNA样品：浓度≥100ng/ul、体积≥20ul的总DNA样品；

2、血液样品：请提供≥500ul抗凝血；采用标准的采样管， EDTA 抗凝或枸椽酸钠抗凝；

3、组织样品：请提供足量的组织样品（≥300mg）；

4、细胞（≥10⁶ ）；

5、甲基化位点信息：可提供甲基化岛分析。

实验报告

1、MSP：引物序列、实验报告、包括MSP产物的电泳图片；

2、BSP：引物序列、测序峰图、阳性克隆质粒和实验报告。