EMSA(凝胶迁移或电泳迁移率实验)

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一、技术介绍:

凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,适用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验,主要是验证蛋白质与特定核酸序列的结合特性,从而间接推断已知蛋白质的靶序列或已知序列的结合蛋白质分子。可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

 

二、实验流程:

探针设计合成-样本制备-预电泳-电泳-转膜-紫外交联-封闭-抗体孵育-洗脱-化学发光-结果分析。

三、实验步骤:
(1)核蛋白提取(核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒,详细步骤见试剂盒说明书) 。
(2)制胶 (1.5mm胶,大约30min胶会凝)
待胶完全凝固后120v预电泳1h,缓冲液用预冷的0.5×TBE。
(3)蛋白与探针反应(注:蛋白浓度1 μg/μl ,上样体积2 μl)
混合后室温放置25-30min。
(4)上样
预电泳完后马上更换预冷的电泳缓冲液,加4μl的6×上样缓冲液到样品混合液中,马上上样电泳,150v ,60min。
(5)电转移
将带正电的尼龙膜放入0.5×TBE中平衡10min。待电泳完成后将加有样品的整块胶取下电转。转膜缓冲液为预冷的0.5×TBE,300mA转印 30min。
(6)交联
转膜完成后将膜取出,于紫外灯下20cm处作用20min。
(7)封闭
将交联完成的尼龙膜取出放入洗净的孵育槽,用封闭液封闭20min。期间放于摇床上轻柔摇晃(慢摇)。
(8)抗体反应
倒掉封闭液。用封闭液将抗体稀释300倍后,与膜完全作用30min。期间放于摇床上轻柔摇晃(慢摇)。
(9)洗脱
用1×的洗脱液清洗4次,每次10min。摇床速度加大。
(10)ECL发光检测:

将膜从洗脱液中取出,稍微吸干上面的液体,放入化学发光仪中,加上化学发光液,待反应1-2min后,吸尽多余的液体,开始化学发光。

四、结果案例:

 

五、样本要求:
1.样本类型:

(1)新鲜组织,100mg以上,干冰运输;

(2)细胞量要求为10^7以上,收集细胞沉淀,干冰运输;

(3)抗体要求为EMSA级别,-20或者4℃运输。

2.客户提供:

(1)基因信息、蛋白信息、物种信息;

(2)转录因子特异性抗体。

北京天融慧通科技有限责任公司,专注于生命科学最前沿科研技术服务,具有较好的生物学和医学技术服务平台,能够提供细胞实验、动物模型、病理检测、分子实验、免疫检测、病毒包装、组学服务、基因编辑等整体课题一站式服务。

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martin
  • 本文由 发表于 2025年3月20日 12:05:26
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匿名

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